Je důležité dodržovat skladovací teplotu?

• ELISA a Westernblot soupravy skladujte vždy při předepsané teplotě 2-8 ^°C.
• Soupravu, která zmrzla, nelze použít.
• Při skladování soupravy se vyhněte umístění v zařízeních s automatickým odmrazováním. Dochází zde ke kolísání teploty.

Je možné zaměňovat komponenty v soupravách?

• Používejte výhradně komponenty z jednoho balení, pokud není uvedeno v pracovním návodu jinak.
• Nezaměňujte reagencie různých šarží mezi sebou nebo v kombinaci s jinými výrobci.
• Po dokončení testu vraťte všechny komponenty do originálního obalu. Předejdete tak záměně s komponentami jiných šarží nebo výrobců.

Může prostředí laboratoře ovlivnit výsledky testů?

• Soupravu je třeba před použitím vytemperovat na laboratorní teplotu. Při nedostatečném nebo prudkém ohřátí dojde k výraznému posunu dosažených hodnot a výsledky nemusí být validní.
• Test provádějte pokud možno v prostorách s běžnou laboratorní teplotou (20-25 ^°C). Nižší či vyšší teplota má vliv na dosažené hodnoty.
• Test neprovádějte v přítomnosti reaktivních par (kyseliny, zásady, aldehydy) nebo v prašném prostředí. Nelze vyloučit vliv na enzymovou aktivitu konjugátu.

Jak pracovat s vyšetřovanými vzorky?

• Všechny vzorky je třeba před použitím vytemperovat na laboratorní teplotu a dobře promíchat. Vlivem nízké teploty při skladování se značně liší koncentrace na dně a při povrchu roztoků. Nehomogenní vzorky mohou způsobit falešně pozitivní nebo negativní reakce.
• Vzorky obsahující viditelné částice je nutno před vyšetřením pomalu centrifugovat.
• Vždy používejte pouze čerstvě naředěné vzorky. Pro opakované vyšetření je třeba vzorky naředit znovu.

Může charakter vzorku ovlivnit výsledek testu?

• Vzorky bakteriálně kontaminované, hemolytické, chylózní a antikoagulanty v plasmě (s výjimkou citrátu) mohou ovlivnit výsledek testu.
• Tepelná inaktivace séra (plazmy) může způsobit nespecifické výsledky.
• Dobře uzavřené vzorky lze skladovat 1 týden při teplotě 2-8 ^°C. Při skladování vzorků delším je třeba je uchovávat při teplotě -20 ^°C v dobře uzavřených nádobkách (např. Eppendorf). Nedoporučujeme opakované rozmrazování, které může vést k nespecifickým výsledkům.

Jaká jsou kritická místa při práci s jednotlivými komponentami soupravy?

Pomůcky:

• Pro přípravu a použití reagencií vždy používejte čisté, nejlépe jednorázové pomůcky. Jakákoliv kontaminace může vést ke špatným výsledkům.
• Nikdy nepoužívejte tutéž nádobku (vaničku) k přípravě nebo pipetování více reagencií současně.
• Na reagencie nepoužívejte nádobky s kovovým víčkem.
• Pro přípravu pracovního ředění roztoků používejte pouze destilovanou vodu z kvalitních destilačních přístrojů bez kontaminace kovovými ionty z elektrod.
• Pro přípravu pracovních koncentrací roztoků je třeba používat čisté nádobky, po umytí opláchnuté deionizovanou (destilovanou) vodou nebo jednorázové pomůcky.

Mikrotitrační destička:

• Před otevřením sáčku s destičkou vytemperujte na laboratorní teplotu, předejdete vysrážení vzdušné vlhkosti.
• Zbytek nepoužitých stripů vždy vraťte do sáčku z originálního balení spolu se sušidly a hermeticky uzavřete. Chraňte před vlhkostí.
• Stripy mikrotitrační destičky potažené antigenem lze použít jen jednou.
• Sledujte značení stripů u jednotlivých souprav. Předejdete chybám při jejich záměně.
• Při promývání a pipetování se nedotýkejte vnitřního povrchu jamek mikrotitrační destičky. Může dojít k poškození navázaného antigenu.

Pravidla pro práci s roztoky:

• Všechny reagencie je třeba před použitím dobře promíchat. Vlivem nízké teploty při skladování se značně liší koncentrace na dně a při povrchu roztoků.
• Před otevřením lahviček s reagenciemi poklepejte dnem na podložku. Odstraníte tím případné zbytky roztoku z víčka.
• Lahvičky s reagenciemi uzavřete ihned po použití. Předejdete vypařování a kontaminaci obsahu.
• Pozor na záměnu víček reagencií. Předcházejte vzájemné kontaminaci reagencií. Může dojít k jejich vzájemnému znehodnocení.
• Zbytky použitých reagencií nevracejte zpět do lahviček. Může dojít ke znehodnocení zbývajícího obsahu.

Roztoky:

• Reagencie citlivé na světlo (TMB - Complete) nevystavujte přímému slunečnímu záření.
• Roztok TMB má být bezbarvý, případně lehce namodralý. Jestliže má sytě modrou barvu, došlo k jeho znehodnocení a nelze ho v testu použít.
• Pokud jsou v testu kontroly v pracovním ředění, dále je neřeďte. Dosáhnete chybných výsledků.
• Kontroly musí být zařazeny v každém testu. Jen tak lze zjistit, zda test proběhl správně.

Co je třeba zkontrolovat před začátkem pipetování?

• K pipetování používejte pouze kalibrované a validované pomůcky, které zaručí dobrou reprodukovatelnost výsledků. Špatné objemy reagencií v testu vedou k chybným a nestandardním výsledkům.
• Před provedením testu zkontrolujte objemy nastavené na pipetách. Vždy pipetujte pouze předepsaný objem reagencií.
• Před zahájením pipetování do mikrotitrační destičky se ujistěte, že stripy dobře drží v rámečku. Hrozí převrhnutí, porucha promývačky nebo fotometru.
• Než začnete pipetovat, zkontrolujte štítek na lahvičce. Předejdete zbytečným chybám při záměně komponent.

Jak ovlivní výsledek testu technika pipetování?

• Při pipetování vzorků a reagencií vždy dbejte na vyměňování špiček. Zabráníte tak jejich vzájemné kontaminaci a znehodnocení testu.
• Do jamek pipetujte ve stejném rytmu a pořadí všechny po sobě následující reagencie. Zvláště při větším počtu vzorků dosáhnete standardnějších výsledků.
• Dva po sobě následující vzorky jednoho pacienta (párová séra) vyšetřujte vždy vedle sebe v jednom testu. Jen tímto způsobem dosáhnete správných výsledků.
• Při pipetování reagencií do jamek mikrotitrační destičky se vyhněte kontaminaci ostatních jamek.
• Během testu nesmí jamky potažené antigenem vyschnout. Reagencie pipetujte ihned po promytí. Hrozí znehodnocení výsledků.
• Po napipetování poslední jamky zakryjte mikrotitrační destičku víčkem, vložte do termostatu a ihned nastavte budík na požadovaný čas. Přesné dodržování inkubační doby je velmi důležité.

Je důležité dodržovat počet promývacích cyklů?

• Dodržujte stanovený počet promývacích cyklů a způsob jich provedení (úplné naplnění a odsátí jamek). Správné promytí má zásadní vliv na výsledky testu.
• Při použití promývačky dbejte na její důkladné promytí po předchozím testu. Zbytek jiného roztoku v přístroji může zcela znehodnotit vaše výsledky.
• Po dokončení promývání je třeba z jamek důkladně odstranit zbytky promývacího roztoku vyklepáním do savého materiálu. Při nedodržení tohoto postupu dojde k naředění následující reagencie a ovlivnění výsledků.
• Používejte správný způsob promývání. Při vytřepávání destičky po inkubaci bez předchozího odsátí obsahu jamek hrozí smíchání vzorků a falešné pozitivity.
• Mikrotitrační destičku promyjte ihned po dokončení inkubace. Čekání na promytí prodlužuje inkubační doby mimo stanovený limit a vede k nestandardním výsledkům.

Jaká je výhoda inkubace při 37 ^°C oproti inkubaci při laboratorní teplotě?

• Standardní teplota v inkubátoru eliminuje negativní vlivy zevního prostředí – kolísání laboratorní teploty např. v různých ročních obdobích. Nižší či vyšší teplota má vliv na dosažené hodnoty.
• Inkubace při 37 ^°C umožňuje zkrácení inkubační dob a tím zkrácení celkové doby celého testu.
• Pravidelně kontrolujte nastavení správné teploty v termostatu. Ne vždy odpovídá hodnota na dispeji přístroje skutečné teplotě uvnitř termostatu. Destičky nepokládejte na vyhřívanou plochu v přístroji.
• Před zahájením inkubace v termostatu odstraňte případné bublinky z jamek lehkým poklepem na rámeček mikrotitrační destičky. Vzduchové bubliny mění standardní objem v jamkách.
• Před inkubací vždy zakryjte destičku víčkem. Předejdete tak vypařování reagencií v termostatu i případné kontaminaci odkrytých jamek.

Co zkontrolovat před změřením dosažených absorbancí?

• Zkontrolujte nastavení správné vlnové délky.
• Zkontrolujte, že je spodní strana jamek mikrotitrační destičky suchá a čistá. K otření používejte vhodný materiál nezanechávající vlákna. Znečistěné dno jamky může způsobit chybný výsledek.
• Změřte intenzitu zbarvení roztoků v jamkách do 30 minut po zastavení reakce.

Jak správně manipulovat s WB stripy?

• Stripy jsou poměrně křehké a vyžadují opatrnost při zacházení s nimi.
• Po otevření sáčku a otevření záložky se stripy opatrně pomocí pinzety uchopte stripy za oblast etikety.
• Nespotřebované stripy ihned vraťte do sáčku se sušidlem a uzavřete jej pomocí přiložené uzavírací lišty, zabráníte tak kontaktu se vzdušnou vlhkostí a tím znehodnocení stripů.
• Vyvarujte se jakéhokoliv kontaktu s membránou.
• Stripy okamžitě vložte do vaničky, v průběhu detekce musí být stripy ve vaničce vždy obráceny čelní stranou nahoru – tj. stranou na níž je vyznačena startovní linie.
• Stripy musí být dokonale smočeny.

Jaké jsou možnosti validace testu metodou Westernblot?

• WB stripy obsahují tzv. cut-off linii, která slouží ke kontrole funkčnosti a citlivosti soupravy a současně usnadňuje vyhodnocení testu.
• Při absenci cut-off linie nebylo dosaženo citlivosti potřebné k správnému provedení testu.
• V případě potřeby další validace stanovení použijte Pozitivní a Negativní kontrolu (jsou součástí souprav a jsou v konečném ředění).
• Validita je splněna tehdy, jestliže je dosaženo shody výsledného vzhledu stripu při aplikaci Pozitivní kontroly s validačním stripem, vyobrazeným na protokolu obsaženém v soupravě. (Pozitivní kontrola obsažená v soupravě nemusí obsahovat všechny specifické linie).
• Po ukončení reakce stripy okamžitě přeneste z vaničky na filtrační papír a usušte. Zabráníte tak zvyšování pozadí stripů.
• Vyhodnocujte stripy až v dokonale vysušeném stavu – mokrý a dokonale vysušený strip se liší intenzitou zbarvení linií a pozadí.